1  適用范圍

酶底物法適用于生活飲用水及其水源水、地表水、污水、廢水等水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）的定性檢測、定量檢測

2  方法原理

固定底物酶底物法（DST）采用大腸菌群細菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶分解ONPG使培養(yǎng)液呈黃色的原理，來判斷水樣中是否含糞大腸菌群（耐熱大腸菌群），糞大腸的培養(yǎng)溫度是44.5℃。

3  儀器設(shè)備

3.1 程控定量封口機（酶底物法程控定量封口機）

智能程控定量封口機是由智能電路電驅(qū)動，內(nèi)部專用加熱輥，專門用于51孔定量盤和 97 孔定量盤封膜作用，配合微生物檢測試劑使用，提供簡單、快速、準(zhǔn)確的定量檢測總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞（耐熱）大腸菌群、腸球菌和綠膿假單胞菌的實驗方案；51 孔定量盤和 97 孔定量盤是基于傳統(tǒng)方法ZUI大可能數(shù) (MPN) 統(tǒng)計模型而設(shè)計的半自動定量方法，可定量檢測出水樣結(jié)果，這種方法可以替代并優(yōu)于傳統(tǒng)（濾膜、及多管發(fā)酵）方法檢測水中微生物。

3.2電熱恒溫培養(yǎng)箱

3.3 冰箱

3.4 51孔定量盤、97孔定量盤

3.5 100ml無菌水樣瓶

3.6 高壓蒸汽滅菌鍋

3.7 干熱滅菌器

3.8 量筒

3.9 吸管

3.10 試管

4  培養(yǎng)基和試劑

4.1 科立得（固定底物技術(shù)酶底物法）檢測試劑：MMO-MUG培養(yǎng)基

4.2 無菌水

5  樣品的采集和保存

5.1采樣前準(zhǔn)備：

5.1.1 采樣瓶：采用IDEXX公司科立得 系統(tǒng)配套的滅菌100毫升消毒帶刻度容器。

5.2 樣品采樣及注意事項

5.2.1將已滅菌和封包好的采樣瓶，無論在什么條件下采樣時，均要小心開啟包封紙和瓶蓋，避免瓶蓋及瓶子頸部受雜菌污染，并注意在使用船只或附帶的采樣繩等附加設(shè)備采樣時可能造成的污染。

5.2.2 在采集江、河、湖、庫、地表水樣時，可握住瓶子底部直接將采樣瓶插入水中，約距水面10~15厘米處，瓶口朝來水方向，使水樣灌入瓶內(nèi)。如果沒有水流，可握住瓶子水平前推，直至充滿水樣為止。采好樣后，迅速蓋上瓶蓋和包裝紙。采樣后，采樣瓶內(nèi)上部應(yīng)留有一些空隙，以便檢驗前充分混勻水樣。

5.2.3 用采樣器采樣時，將無菌的水樣瓶放入架內(nèi)。將采樣裝置放入水中。到達預(yù)定深度后，打開瓶塞，待水樣灌好后，松開瓶塞的軟繩，蓋上瓶蓋。再將整個裝置提出水面。

5.2.4 從自來水龍頭采集樣品時，不要選用漏水的龍頭，采水前可先將水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌或用70%的酒精溶液消毒水龍頭及采樣瓶口，然后將水龍頭完全打開，放水?dāng)?shù)分鐘后除去水管中的滯留雜質(zhì)。采水時控制水流速度小心接入瓶內(nèi)。

5.2.5在同一采樣點進行分層采樣時，應(yīng)自上向下進行，以免不同層次的攪擾；同一采樣點與理化監(jiān)測項目同時采樣時，應(yīng)先采集細菌等檢驗樣品，否則樣品可能被污染，采樣前，不得用水樣刷洗采樣瓶。

5.2.6采樣完畢，應(yīng)將采樣瓶編號、作好采樣記錄。將記錄下采樣條件，填入采樣表格內(nèi)。

5.2.7 樣品的運輸和保存

采好的水樣，應(yīng)迅速運往實驗室，進行細菌學(xué)檢驗，一般從取樣到檢驗不宜超過2小時，不然應(yīng)使用10℃以下的冷藏設(shè)備保存樣品，但不得超過6小時，實驗室接到送檢樣后，應(yīng)將樣品立即放入冰箱，并在2小時內(nèi)著手檢驗。如果因路途遙遠，送檢時間超過6小時者，則應(yīng)考慮現(xiàn)場檢驗。

5.3 樣品交接

樣品運回實驗室后，由采樣人員與質(zhì)管科樣品管理人員進行交接。雙方需對樣品名稱、編號、樣品采集點名稱、采樣時間、數(shù)量、采樣人簽名等進行登記核實。如在驗收過程中，發(fā)現(xiàn)編號錯亂、字跡不清、規(guī)格不符、監(jiān)測項目不明及采樣不合要求者，可拒收并建議補采。如無法補采，應(yīng)經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)，方可收樣測定。樣品管理人員收樣后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)交檢測人員以便及時進行分析。

5.4干擾與消除：防止操作過程中的污染，嚴格無菌操作。

6  操作步驟

6.1 水樣稀釋

檢測所需水樣為100mL。若水樣污染嚴重，可對水樣進行稀釋。取10 mL水樣加入到90 mL無菌水中，必要時可加大稀釋度，水樣按照10倍逐級稀釋。

6.2 定性反應(yīng)

用100 mL的無菌稀釋瓶量取100 mL水樣，加入科立得培養(yǎng)基粉末，混搖均勻使之完全溶解后，放入44.5℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

6.3 51孔定量盤法

6.3.1 用100 mL的無菌稀釋瓶量取100 mL水樣，加入科立得培養(yǎng)基粉末，混搖均勻使之完全溶解。

6.3.2 將前述100mL水樣全部倒入51孔無菌定量盤內(nèi)，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機封口。放入44.5℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

6.3.3 無需稀釋檢測范圍：1-200MPN/100mL糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）

6.4 97孔定量盤法

6.4.1 將100mL水樣全部倒入97孔無菌定量盤內(nèi)，其余步驟與6.3.1、6.3.2條款相同。

6.4.2 無需稀釋檢測范圍：1-2419MPN/100mL糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）

7  結(jié)果報告

7.1 結(jié)果觀察與報告

7.1.1 結(jié)果判讀

將水樣培養(yǎng)24h后進行結(jié)果判讀，如果結(jié)果為可疑陽性，可延長培養(yǎng)時間到28h進行結(jié)果判讀，超過28h之后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽性結(jié)果。

7.1.2 定性反應(yīng)

水樣經(jīng)24h培養(yǎng)之后如果顏色變成黃色，判斷為陽性反應(yīng)，表示水中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。水樣顏色未發(fā)生變化，判斷為陰性反應(yīng)。定性反應(yīng)結(jié)果以糞大腸菌群檢出或未檢出報告。

7.1.3   51孔定量盤法、97孔定量盤法

7.1.3.1 將培養(yǎng)24h的水樣的定量盤取出觀察，如果顏色變成黃色則表示定量盤孔中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。若無法明顯辨別黃色孔格，則可借助97孔陽性比色盤比色判讀。檢測結(jié)果說明如下：

7.1.3.2 計算有陽性反應(yīng)的孔穴數(shù)，對照附表1：51孔定量盤MPN表或者附表2：97孔定量盤MPN表查出代表的糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）最可能數(shù)。結(jié)果以MPN/100mL表示。如所有孔未產(chǎn)生黃色，則可報告為糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）未檢出。

7.1.3.3 在無需稀釋檢測范圍內(nèi)直接可讀出結(jié)果。若水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）污染嚴重，超出定量范圍（全部孔格顯黃色）則需要稀釋，讀取結(jié)果后再乘以稀釋倍數(shù)。

8  質(zhì)控

每批科立得試劑需做驗證檢驗：向一份100mL無菌水樣中接種含有糞大腸菌的質(zhì)控樣標(biāo)準(zhǔn)菌株，按照上述定量檢測步驟操作觀察結(jié)果，看結(jié)果是否在其范圍內(nèi)。

9  注意事項

9.1 如果水樣品有背景顏色，需做一個空白試驗，與科立得標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果相比較。

9.2 只可使用滅菌水，不含緩沖液的水，不含氧化劑的水進行樣品稀釋。

9.3 此法所用試劑只用于常規(guī)水樣，不可用于濃縮水樣。

9.4 如水樣中含有過多的氯，則加入科立得試劑可能顯藍光，則該水樣不可用此方法。

9.5 此法無需在無菌室中進行，但操作過程因避免微生物污染。

9.6 檢測使用過的定量盤應(yīng)滅菌后棄去。把約30個定量盤放入防爆袋中，用繩子松松的扎住袋口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓滅菌20min后取出，在防爆袋上注明“生物垃圾已滅菌”方可棄去。

附表1：51孔定量盤MPN表

附表2：97孔定量盤MPN表